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        WB過程中常見的問題分析及解決辦法 WB過程中常見的問題分析及解決辦法

        發(fā)布時間: 2023-11-07  點擊次數(shù): 1098次

        可能原因

        驗證或解決辦法


        背景高

        膜沒有W全均勻濕透

        使用100% 甲醇浸透膜5-10min

        洗膜不充分

        增加洗液體積和洗滌次數(shù)

        阻斷不充分

        增加封閉液孵育時間,或者提高溫度。選擇合適的封閉試劑(脫脂奶粉,BSA,酪蛋白等)

        二抗?jié)舛冗^高

        降低二抗?jié)舛?/span>

        檢測過程中膜干燥

        保證充分的反應(yīng)液,避免出現(xiàn)干膜現(xiàn)象

        曝光過度

        縮短曝光時間

        抗體與阻斷蛋白有交叉反應(yīng)

        檢測抗體與阻斷蛋白的交叉反應(yīng)性,選擇無交叉反應(yīng)的封閉劑。洗滌液中加入Tween-20可減少交叉反應(yīng)

        沒有陽性條帶,或者陽性條帶比較弱

        抗體染色不充分

        增加抗體濃度,延長孵育時間

        酶失活

        直接將酶和底物進(jìn)行混合,如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物

        標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低

        設(shè)置陽性對照,如果陽性對照有結(jié)果,但標(biāo)本沒有則可能是標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低??煽紤]增加標(biāo)本上樣量解決靶蛋白含量低的原因。

        試劑不匹配

        一抗與組織種屬,一抗與二抗或/和底物與酶系統(tǒng)之間不匹配。通過設(shè)置內(nèi)參照可以驗證二級檢測系統(tǒng)的有效性

        一抗失效

        選擇在有效期內(nèi)抗體;并選擇現(xiàn)配現(xiàn)用的工作液

        HRP抑制劑

        所用溶液和容器中避免含有D氮化鈉

        膜沒有W全均勻濕透

        使用100%甲醇浸透膜

        靶蛋白分子量小于10Kd

        選擇小孔徑的膜,縮短轉(zhuǎn)移時間

        甲醇濃度過高

        過高甲醇濃度會導(dǎo)致蛋白質(zhì)與SDS分離,從而沉淀在凝膠中,同時會使凝膠收縮或變硬,從而抑制高分子量蛋白的轉(zhuǎn)移。降低甲醇濃度或者使用乙醇或異丙醇代替

        轉(zhuǎn)移時間不夠

        對于厚的膠以及高分子量蛋白需要延長轉(zhuǎn)移時間

        抗體染色不充分

        增加抗體濃度,延長孵育時間

        標(biāo)本中靶蛋白含量太低

        增加標(biāo)本上樣量。

        HRP抑制劑

        所用溶液和容器中避免含有D氮化鈉

        抗體活性降低

        選擇在有效期內(nèi)的抗體,工作液現(xiàn)配現(xiàn)用,避免長時間放置

        封閉過度

        減少封閉劑的量或縮短時間;換用不同封閉劑類型

        曝光時間過短

        延長曝光時間

        條帶位置不對;或有非特異性條帶

        色帶)

        二抗的非特異性結(jié)合

        增加一個對照:不加一抗,其他操作過程不變,即可驗證背景是否由二抗系統(tǒng)來源。選擇其他二抗(特異性更強(qiáng)的,只針對重鏈的)

        一抗的特異性不夠

        使用單克隆或者親和純化的抗體,保證抗體的特異性

        蛋白降解

        使用新鮮制備的標(biāo)本,并使用蛋白酶抑制劑

        二聚體或多聚體存在

        增加蛋白質(zhì)變性過程及強(qiáng)度

        抗體濃度過高

        降低抗體(一抗、二抗)濃度,可以減少非特異性條帶

        蛋白上樣量過大

        降低上樣量

        封閉劑中有聚集體

        使用前過濾封閉試劑

        HRP耦聯(lián)二抗中有聚集體

        過濾二抗試劑,去除聚集體

        HRP含量過高

        降低酶聯(lián)二抗的濃度

         



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